Cas12a2 provoca un'infezione abortiva attraverso l'RNA

Nov 06, 2023

Natura volume 613, pagine 588–594 (2023) Citare questo articolo

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I sistemi di infezione batterica abortiva limitano la diffusione di invasori stranieri bloccando o uccidendo le cellule infette prima che gli invasori possano replicarsi1,2. Diversi sistemi CRISPR-Cas mirati all'RNA (ovvero i tipi III e VI) causano fenotipi di infezioni abortive attivando nucleasi indiscriminate3,4,5. Tuttavia, deve ancora essere osservato un meccanismo abortivo mediato da CRISPR che sfrutta l’attività indiscriminata della DNasi di una nucleasi a singolo effettore guidata da RNA. Qui riportiamo che il targeting dell'RNA da parte della nucleasi a singolo effettore di tipo V Cas12a2 guida l'infezione abortiva attraverso la scissione non specifica del DNA a doppio filamento (dsDNA). Dopo aver riconosciuto un bersaglio di RNA con una sequenza di attivazione fiancheggiata dal protospacer, Cas12a2 degrada in modo efficiente l'RNA a filamento singolo (ssRNA), il DNA a filamento singolo (ssDNA) e il dsDNA. All'interno delle cellule, l'attivazione di Cas12a2 induce una risposta SOS al danno del DNA e ostacola la crescita, impedendo la diffusione dell'invasore. Infine, abbiamo sfruttato l'attività collaterale di Cas12a2 per il rilevamento diretto dell'RNA, dimostrando che Cas12a2 può essere riproposto come strumento di targeting dell'RNA guidato dall'RNA. Questi risultati espandono le capacità difensive note dei sistemi CRISPR-Cas e creano ulteriori opportunità per le tecnologie CRISPR.

Tutti gli ambiti della vita utilizzano strategie di difesa che fanno sì che le cellule entrino in letargo o muoiano per limitare la diffusione di agenti infettivi1. Nei batteri e negli archaea, questa strategia è chiamata infezione abortiva ed è utilizzata da un'ampia varietà di sistemi di difesa batterici1,2. Recentemente, è stato dimostrato che i sistemi immunitari adattivi guidati da CRISPR RNA (crRNA) che prendono di mira l'RNA causano fenotipi di infezione abortiva3,4,5,6. I sistemi di tipo VI degradano in modo non specifico l'RNA, per cui la nucleasi a singolo effettore Cas13 agisce sia come effettore guidato dal crRNA che come RNasi indiscriminata3,7,8. Nei sistemi di tipo III, il legame dell'RNA bersaglio innesca la produzione di messaggeri secondari di oligoadenilato ciclico che a loro volta attivano RNasi accessorie e ssDNasi indiscriminate che possono causare infezioni abortive4,5,9,10,11. Inoltre, è stato proposto che l'infezione abortiva sia mediata da dsDNasi indiscriminate (come NucC) attivate attraverso messaggeri secondari di tipo III12,13 o dall'attività indiscriminata di ssDNasi da nucleasi a singolo effettore Cas12a di tipo V14. Tuttavia, l'attività della dsDNasi mediata da CRISPR di tipo III deve ancora essere esaminata in vivo e recentemente è stato dimostrato che l'attività della ssDNasi di Cas12a non causa un'infezione abortiva15.

Qui riportiamo che Cas12a2, una nucleasi associata a CRISPR (Cas) a singolo effetto di tipo V, induce un fenotipo di infezione abortiva quando sfidato con plasmidi complementari alle guide di crRNA. Saggi biochimici utilizzando proteine ​​ricombinanti hanno rivelato che Cas12a2 riconosce bersagli di RNA, liberando attività non specifiche di dsDNA, ssDNA e ssRNA-nucleasi distinte da quelle di altri RNA-targeting a subunità singola (come Cas13a) e dsDNA-targeting (come Cas12a ) Cas nucleasi8,16,17. Inoltre, mostriamo che le attività della nucleasi non specifica Cas12a2 danneggiano il DNA batterico, innescando la risposta SOS e compromettendo la crescita cellulare. Collettivamente questi risultati suggeriscono che l'attività dsDNasi di Cas12a2 è determinante nell'innescare il fenotipo dell'infezione abortiva. Come dimostrazione di principio, mostriamo che Cas12a2 può rilevare l'RNA con una sensibilità paragonabile a quella della nucleasi Cas13a mirata all'RNA a varie temperature.

Cas12a2 comprende un gruppo di nucleasi effettrici di tipo V correlate a Cas12a16, con gli ortologhi Cas12a2 precedentemente classificati come varianti Cas12a18. Le nostre analisi li collocano in modo simile in un clade monofiletico che condivide l'ultimo antenato comune con le nucleasi Cas12a (Fig. 1a e Dati estesi Fig. 1). Ulteriori analisi hanno rivelato che i sistemi CRISPR-Cas12a2 e CRISPR-Cas12a presentano ripetizioni CRISPR con un'estremità 3 ′ conservata e le nucleasi possiedono domini endonucleasici RuvC omologhi e una struttura secondaria prevista simile negli N terminali (Fig. 1b e Fig. 2 supplementare) . Nonostante i domini simili a RuvC e gli N terminali conservati, Cas12a2 si distingue da Cas12a per la presenza di un ampio dominio con funzione sconosciuta situato al posto dell'elica del ponte Cas12a e di un dominio zinc-finger al posto del dominio Nuc Cas12a ( Fig. 1b e Fig. 2 supplementare). Considerando la loro classificazione originale combinata con le nostre analisi filogenetiche e con i recenti risultati strutturali19, abbiamo chiamato queste distinte nucleasi di tipo V Cas12a2.